缓慢乙型病毒性肝炎影响着全球超越 2.5 亿人口，每年约有 65 万人死于 HBV 相关终晚期肝病。共价闭合环状（ccc）DNA 是缓慢乙肝继续感染的首恶，作为病毒仿制的中介，其在宿主肝细胞核内以微染色体的方法存在，现在的医治手法难以将其完全铲除，然后到达缓慢乙肝的完全治好。
近期的 Gut 杂志上宣布了德国弗莱堡大学医院 Nassal 教授的一篇总述，该文概述了 cccDNA 的研讨前史、现在研讨中存在的困难、近期的研讨进展以及与之相关的医治战略。
HBV 的感染与仿制
人 HBV 是嗜肝 DNA 病毒的原型，同属哺乳动物的正嗜肝 DNA 病毒还有旱獭肝炎病毒（WHV）、地松鼠肝炎病毒（GSHV）、毛猴乙型肝炎病毒（WMHBV）等，此外还有水禽类嗜肝 DNA 病毒，如鸭乙型肝炎病毒（DHBV）、鹭乙型肝炎病毒（HHBV）。
1. HBV 的结构特征
如图 1A 所示，HBV 病毒，或称「Dane 颗粒」，由含有 3 种外膜蛋白（血清学上的 HBsAg）的包膜包裹核衣壳（血清学上的 HBcAg）构成。核衣壳内包含的病毒基因组是一个部分双链的松懈环状 DNA，即 RC-DNA。
HBV 基因组最显着的特征在于其结构严密，功用完全（图 1B）。HBV 基因组的开放阅读框（ORF）存在重合，一个 ORF 可转录 2 种 mRNA，编码 2 种蛋白，一切基因表达和仿制一切必要的调理原件都埋在基因序列中。
图 1.HBV 的根本分子特征。图 A 为病毒结构；图 B 为基因构成（绿色箭头：启动子；EnHⅠ/EnH‖：转录增强子；DR1，DR2：直接重复序列；赤色波涛线：正链 DNA 上的 RNA 引物）。
2. HBV 的感染与仿制
如图 2 所示，HBV 感染肝细胞始于病毒颗粒外表 L 蛋白被肝细胞外表钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）受体辨认并结合，或许以内吞方法进入细胞。在胞浆中释放出核衣壳，核衣壳在中心蛋白核定位信号的效果下，进入胞核，并释放出 RC-DNA，并终究构成 cccDNA。
cccDNA 与核小体结合构成独立于细胞染色体外的细小染色体结构，这一进程有赖于 HBx 和中心蛋白的参加。
cccDNA 是病毒转录的模板，其运用宿主细胞的 RNA 聚合酶进行转录，可发生 3 种亚基因组 RNA，用于组成病毒蛋白，以及 2 种善于基因组的 RNA，用于病毒仿制、转译核壳等。有用的 cccDNA 转录遭到肝脏特异性转录因子及 HBx 的调控。
在细胞浆中，pgRNA 和病毒 P 蛋白一同被新构成的核壳蛋白包裹，在此以 pgRNA 为模板，逆转录构成负链，随后 pgRNA 降解，正链组成，新的 RC-DNA 构成。含有 RC-DNA 的老练中心颗粒包裹外膜蛋白，在细胞多泡体的参加下排泄出细胞，此外，重生的老练中心颗粒还能够再次入核，扩大细胞的 cccDNA 池。
图 2. 肝细胞中 HBV 的生命周期（GVG：粘多糖；NTCP：钠-牛磺胆酸共转运多肽）
研讨 cccDNA 的技能壁垒
1. 宿主特异性的约束
由上述 HBV 感染的生命周期可见，cccDNA 是 HBV 在肝内进行仿制的模板，是树立有用感染的根底。但是，因为 HBV 的宿主规模极窄，现在仅有少数、杂乱的体外感染体系可用于研讨 cccDNA。
运用相应宿主的原代肝细胞是处理这一难题的战略之一，但人的肝细胞取得困难，代替动物树鼩养殖要求高，价格昂贵。此外原代肝细胞存在最首要的问题在于伴跟着 NTCP 表达的逐步缺失，其对 HBV 的易理性也很快下降。长时刻 HBV 易理性可经过向免疫缺点小鼠移植人或许树鼩的肝细胞完成，但技能十分杂乱。
2. NTCP 受体发现带来的期望
NTCP 作为 HBV 受体这一发现为 cccDNA 的研讨供给了极大便当，经过表达 NTCP 受体，试验中常用的 HepG2、Hu7 等细胞系均可被 HBV 感染，但要取得高感染率仍需在培育体系中参加适当高剂量的病毒颗粒（细胞数量的 104 倍）来完成。
3. 非感染模型难以构成 cccDNA
研讨 HBV 的非感染模型，向细胞转染 HBV 质粒或尾静脉高压打针 HBV 质粒等，cccDNA 构成均很少乃至没有。在这些模型中，质粒代替 cccDNA 成为病毒仿制的首要模板。与之类似的还有 HBV 转基因小鼠，其 HBV 基因是整合在小鼠基因组中的。
4. 鸭肝病毒模型对 cccDNA 的研讨奉献
不同于 HBV，DHBV 在不同的体系中很简单检测到 cccDNA，而鸭肝细胞也相对简单取得，体内试验较为便当。
鸭肝病毒模型说明晰 cccDNA 在肝炎病毒仿制周期和继续感染中的重要效果，首要研讨成果包含：cccDNA 的构成有赖于逆转录，而非 DNA 的半保存仿制；cccDNA 在细胞核内以 cccDNA 池的方法存在，每个细胞核中往往不止 1 个复制；检测单个细胞核内 cccDNA 的技能。
近期有研讨运用带着一种包膜缺点 DHBV 病毒的肝细胞系，如 DStet5，包膜蛋白缺点导致病毒排泄受阻，因而可诱导单个细胞内 cccDNA 水平大幅增加（如图 3），这种 DHBV 在人的肝癌细胞系内也可到达很高的 cccDNA 水平，然后为 cccDNA 的研讨供给了便当。
cccDNA 的检测窘境
1. Southern blot 检测敏理性有限
因为 cccDNA 呈超螺旋结构，比较与平等长度的 RC-DNA，其具有更高的电泳迁移率，因而 cccDNA 可经过 Southern blot 与其他方法的肝病毒基因组进行辨别。
图 3. Southern blot 检测 cccDNA
缓慢感染鸭肝炎模型显现单个细胞内均匀含有 10 复制左右的 cccDNA，不同细胞间复制数改变很大，且跟着感染的病程具有时刻上的动摇。
人慢乙肝单个肝细胞复制数好像更低（均匀 0.1-1 复制/细胞），而 Southern blot 检测下限约为 10 复制/细胞，因而如此低的 cccDNA 水平使得 Southern blot 难以精确的检测到单个细胞的复制数。
2. 其他检测办法难以扫除 RC-DNA 的搅扰
一切根据 PCR 的检测办法，如引物规划在 RC-DNA 正链缺失段两头的「over-gap」PCR，或以环状 DNA 为模板的滚环扩增，但不能必定扫除 RC-DNA 的搅扰。还有非 PCR 的侵入剖析技能，运用一条引物与 cccDNA 构成 3 链结构，这一结构可被特异性的核酸内切酶辨认。
总归，最大化 cccDNA 的挑选性，扫除 RC-DNA 搅扰是精确定量 cccDNA 的要害，只对胞核而非全细胞进行检测，并联合外源性核酸酶特异性降解 RC-DNA 或为一种处理战略。别的应留意单链上的一个缺口即可造成双链解螺旋，导致轻视 cccDNA 载量。
对研讨者而言，应当清楚每一种办法的缺点，并亟需树立一种规范的高敏理性的检测办法。对读者而言，应清楚的知道到，关于现已处于很低水平的 HBV cccDNA，声称进一步下降其载量的数据支撑或并不充沛。
cccDNA 的生命周期
1. 宿主 DNA 修正体系参加 cccDNA 的从头组成
侵入肝细胞的 RC-DNA 是 cccDNA 构成的直接前体，由 RC-DNA 构成 cccDNA 称为「从头组成」，这一进程需求去除负链 5』端的结尾 P 蛋白和 3』端的结尾过剩段（r），两头连接成环，一起正链的 5』端去除 RNA 引物，3』进行延伸，两头闭合。
在 cccDNA 从头组成进程中，病毒 P 蛋白有部分参加，但宿主 DNA 修正体系在其间发挥了重要效果，首要参加的酶有核酸内切酶、酪氨酰磷酸二酯酶、DNA 聚合酶、多核苷酸激酶或磷酸酶、DNA 连接酶等（如图 4）。
图 4. RC-DNA 的结构特征
2. cccDNA 的切当生命周期尚不清楚
核苷类药物停药或免疫抑制状态下病毒反弹提示 cccDNA 可继续存在长达数十年，但现在尚没有人类 cccDNA 消减动力学数据。土拨鼠和鸭肝感染模型提示 cccDNA 的半衰期为 33 和 57 天。黑猩猩急性感染时，cccDNA 半衰期缩短至 3 天，但仍有痕量 cccDNA 可继续数年。
在缓慢感染中，新的 cccDNA 的发生与已存在 cccDNA 的消失遭到很多要素影响，二者的归纳成果决议了 cccDNA 池的巨细。当时，咱们仍无法切当知道单个 cccDNA 分子的生命周期。
有待处理的 cccDNA 生物学问题
1. cccDNA 的生命周期取决于单个分子，仍是存在 cccDNA 的更新？假如存在更新，那么是经过何种途径？（细胞内？细胞间？或细胞外？）其动力学特征怎么？
2. 在急性自限性 HBV 感染中，cccDNA 是怎么被铲除的？
3. 假如细胞能够从 cccDNA 的层面取得免疫学治好，那其详细机制怎么？
4. cccDNA 在细胞分裂进程中是否存活？怎么存活？
5. 什么要素约束了 cccDNA 在大多数人的肝癌细胞系及鼠肝细胞的构成和堆集？
6. 为什么这种约束在鸭 HBV 并不显着，乃至是感染人的细胞？
7. 何种机制约束了 cccDNA 的无限扩增，这种机制可用于削减 cccDNA 的复制数么？
或许的医治靶点
以 cccDNA 作为医治靶点，首要需求说明 cccDNA 的生命周期取决于单个分子的生命期仍是经过更新保持 cccDNA 池。若没有 cccDNA 的更新，那么阻断 RC-DNA 向 cccDNA 改变仅在感染之初有用。
1. 阻断 NTCP 受体
在人源化小鼠模型上，低剂量 HBV 感染后予以 NTCP 受体阻断剂 Myrcludex B 医治，不只能够阻挠病毒播散，还可使已感染细胞 RC-DNA 向 cccDNA 的改变进程受损。这一成果上需求在临床研讨中加以承认。
2. 靶向 DNA 修正体系
第二个或许的靶点是宿主 DNA 修正体系。但是，宿主 DNA 修正体系冗杂巨大，且存在代偿机制，阻断其间某条通络或并不能阻断 cccDNA 的构成，而大规模阻断将影响到细胞自身的 DNA 修正。
3. 阻断 RC-DNA 入核
另一个代替战略是阻断 RC-DNA 前体入核，RC-DNA 的核转运依赖于核衣壳，靶向核衣壳的药物正在研制傍边。
4. 诱导核衣壳在胞浆分化
诱导拼装空的核衣壳或不规则的聚合物，将损坏核衣壳的安稳性，它们或在胞浆中崩溃，RC-DNA 释入胞浆，不只无法到达胞核，反被胞浆 DNA 感受器辨认，诱导 1 型搅扰素的发生。
需求再次着重的是，削减已有的 cccDNA，需求以 cccDNA 池经过更新保持其数量为条件。
5. 功用性失活 cccDNA
cccDNA 的转录遭到外部调控，靶向这些细胞调控机制或到达 cccDNA 功用性失活。这类挑选包含搅扰素α、靶向 HBx 的药物，以及 DNA 损害结合蛋白 DDB1。
但是功用性失活 cccDNA 的限制在于在 cccDNA 存续期间需求继续干涉。此外，转染无转录活性 cccDNA 的细胞对免疫介导的 cccDNA 铲除愈加安稳。因而这一观念需求更多的研讨加以证明。
6. 直接铲除已有 cccDNA
肝细胞内 cccDNA 池的稳态取决于 cccDNA 消长的速度。因为 cccDNA 更新动力学尚不清晰，铲除已有的 cccDNA 好像是愈加开门见山的挑选。在缓慢感染条件下，铲除已有 cccDNA 有两种战略，一是免疫介导的 cccDNA 的铲除，二是规划核酸酶对基因进行修改。
⑴ 免疫铲除
天然免疫和适应性免疫在铲除急性 HBV 感染时发挥重要效果，缓慢 HBV 感染存在免疫应对的缺乏，从头树立有用的免疫应对含义严重。
免疫介导的 cccDNA 铲除包含两个层面：一是从肝细胞内铲除 cccDNA，即非溶细胞式铲除；二是由杀伤性 T 细胞损坏含有 cccDNA 的肝细胞。两种机制在急缓慢 HBV 感染时都存在，但各自的相对奉献尚不清楚。
近期一项研讨提示十分高剂量的搅扰素-α，或有用激活淋巴毒素-β受体可直接靶向效果于 cccDNA 的完好性，经 APOBEC3A 和 B 介导负链去氨基效果，并终究降解 cccDNA。
虽然在某些方面存在争议，Toll 样受体 7 激动剂 GS-9620 的临床前试验成果充满期望，必定了激活天然免疫应对的医治价值。
⑵ 基因修改
在不同免疫介导的 cccDNA 下降进程中，一部分 cccDNA 好像适当固执，难以进一步下降。这或许是含有 cccDNA 细胞自身的特质，也有或许是 cccDNA 存在更难以被分化的方法，例如甲基化、染色体化等。
运用核酸酶进行基因修改的技能进步催生了靶向 cccDNA 的新东西，例如锌指核酸内切酶、类转录激活效应物核酸内切酶、以及 RNA 引导的成簇的规则距离的短回文重复序列 (CRISPR) 基因组修改技能。
这类新技能仍面对许多应战，如不能特异性靶向含有 cccDNA 的肝细胞，线性病毒 DNA 整合到肝细胞基因组，以及 DNA 修正体系或许再次生成完好的 cccDNA 等。此外，细胞内过量的 RC-DNA 是否会影响到药物精确靶向 cccDNA 并不清楚。
因而，开展其他新技能，包含医治性疫苗、反义寡核苷酸和根据 RNA 搅扰等，仍具有宽广的空间。
图 5. 靶向 cccDNA 的潜在医治战略
总结
cccDNA 在 HBV 继续感染中的效果毋庸置疑，治好缓慢乙肝将有必要霸占这一难题。
现在，受限于体内体外试验模型的限制，对 cccDNA 的构成、降解等生物学特性的知道仍存在许多空白，跟着细胞感染体系和小动物模型的树立，这些问题有望在不远的未来得以回答。完全消除 cccDNA，仅依托一种战略或许难以完成，联合对 cccDNA 生化特征的知道、机体在急性感染时免疫体系铲除 cccDNA 的方法以及操作修改 DNA 的新技能，或有望完成这一方针。
期望终有一天，慢乙肝能够像慢丙肝相同被治好。
